De Niro menghadiri "PS 41", sebuah sekolah dasar negeri di Manhattan dan lulus hingga kelas enam. Dia kemudian melanjutkan studi ke Sekolah Elisabeth Irwin, sekolah menengah swasta dari Little Red School House, bersekolah dari kelas tujuh sampai kelas delapan.[13] Beliau diterima di High School of Music and Art untuk kelas sembilan, tetapi hanya hadir dalam waktu yang singkat sebelum pindah ke sebuah sekolah umum.[14]

De Niro memulai sekolah menengah atas di McBurney School[15] dan kemudian menghadiri sekolah swasta Rhodes Preparatory School,[16] meskipun beliau tidak pernah lulus dari salah satu sekolah tersebut.[17] Beliau dijuluki "Bobby Milk" karena muka pucatnya, De Niro bergaul dengan sekelompok anak-anak jalanan saat masa mudanya di Little Italy, beberapa di antaranya masih tetap berteman hingga kini.[18] Arah masa depannya sudah terlihat ketika debut panggung teaternya pada usia 10 tahun, ketika beliau berperan sebagai Cowardly Lion dalam sebuah sandiwara The Wizard of Oz yang diproduksi oleh sekolahnya.[4][19] Beliau berupaya mengatasi rasa malunya lewat pertunjukan, beliau juga terpaku dengan bioskop, dan beliau putus sekolah pada usia 16 tahun untuk mengejar cita-cita berakting.[18] Beliau belajar akting di Stella Adler Conservatory, serta di Actors Studio-nya Lee Strasberg.[17]